En una nueva aventura de desplazamiento lateral en 2D, Mario y Luigi regresan después de casi quince años. El primer juego tradicional de Mario Bros. desde Super Mario World.
Los modelos de los personajes se renderizan en 3D en tiempo real, lo que permite una cantidad mucho mayor de movimientos nunca antes vistos en un título de Mario Bros. Además, como el juego está en DS, la pantalla táctil permite a los jugadores almacenar un encendido adicional y ver la distancia que queda por recorrer en un nivel.
Bowser y Bowser Jr. han secuestrado a la princesa Peach y, por supuesto, depende de Mario y Luigi rescatarla y acabar con los alborotadores. Hay ocho mundos nuevos para explorar, muy parecidos a los de Mario 3: Llanuras, Desierto, Isla tropical, Bosque, Hielo, Montañas, Cielo y Guarida de Bowser.
Los ocho mundos tienen ochenta niveles distintos, así como muchos secretos que solo se encontrarán en un examen cuidadoso. También hay muchos potenciadores nuevos (el mega hongo y el caparazón de Koopa, por ejemplo) para que los hermanos los recolecten.